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IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS
Características
> Identificación a nivel de género y especie.
> Confiable, eficiente y preciso.
Fundamento
Los esquemas tradicionales de identificación microbiana se basan en caracteres observables de la estructura y función de los microorganismos; es decir, son características fenotípicas que son la consecuencia de la expresión de sus genes. Existen situaciones en las cuales la identificación fenotípica necesita mucho tiempo, resulta difícil o, incluso, imposible. En estas circunstancias, la identificación molecular basada en el análisis del ADN puede representar una ventaja tanto en tiempo como en precisión. De esta forma, mediante el análisis directo del genoma microbiano es posible identificar cualquier especie a través de sus rasgos genotípicos.
El análisis de la secuencia de ADN del gen ribosomal 16S es un método consolidado como estándar de referencia para la identificación taxonómica de microorganismos desconocidos, en la mayoría de los casos hasta el nivel de especie.
Se basa en:
1) amplificación por la técnica de PCR (polymerase chain reaction; reacción en cadena de la polimerasa) de la secuencia del gen ribosomal 16S del microorganismo de interés.
2) secuenciación bidireccional del gen amplificado.
3) análisis comparativo en bases de datos públicas para determinar el parentesco más próximo.
Muestras
> Cultivos puros de bacterias viables en medio líquido o agarizado.
> Bacterias inactivas en medio sólido o líquido.
> ADN aislado en solución acuosa o seco.
Tiempo de procesamiento
2-4 semanas (desde la provisión de la muestra, hasta entrega del informe), dependiendo de la dificultad relativa para la amplificación del gen 16S rDNA por PCR.
Resultados
Para cada muestra se provee la secuencia obtenida, el % de similitud de secuencia con el microorganismo más cercano en bases de datos públicas, y un gráfico de representación de proximidad genética con parientes cercanos a nivel de especies y géneros.
CASOS ESPECIALES
> Limitaciones de resolución de especies: la secuenciación y análisis del gen 16S no es infalible como método de asignación taxonómica a nivel de especie, ya que sólo se analiza una porción reducida del genoma total del microorganismo, y para algunos géneros puede resultar insuficiente para discriminar entre diferentes especies (por ejemplo, Bacillus). En estos casos, se puede recurrir al análisis de otros genes marcadores como complemento.
CONSULTAR por proyecto especial.
1) aplicar el método del aislamiento en medio agarizado, para obtener colonias de los distintos microorganismos;
2) extracción directa de ADN, amplificación de los genes 16S, clonado de los fragmentos obtenidos y secuenciación de múltiples clones.
CONSULTAR por proyecto especial.
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